5.3.5. Методи, основани на ДНК – амплифициране с ПВР

Методите, основани на ДНК, разчитат на мултипликация на специфична част от молекулата на ДНК чрез техниката на ПВР. За визуализиране на амплификационните продукти рутинно се използва гел електрофореза. Тя може да се проведе самостоятелно или да се свърже с ендонуклеазно смилане (ПДРФ-ПВР). Един по-сложен вариант на основния ПВР протокол включва определяне на Tm профила чрез средствата на внедряване на багрила в двойната верига на ДНК и излъчване на флуоресцентна светлина. С увеличаване на температурата двете вериги на ДНК започват да се разделят и съответно излъчената светлина, която може да се измери, намалява. Tm е много по-специфична характеристика на ДНК последователностите в сравнение с дължината на ДНК. Друг вариант е използването на сонди и провеждане на хибридизация с ДНК или РНК. Ако се конструира подходяща сонда, то тя може да отдиференцира природните от чуждеродните последователности. Бележейки сондата с радиоактивни или нерадиоактивни съединения може да се улесни детекцията на молекулите. Понастоящем, най-често използваните техники за анализ на ГМО са гел електрофорезата и хибридизацията.

Скринингът на хранителни проби за наличие на ГМO с използване на основния протокол на ПВР включва следните процедури:

• Екстракция на ДНК от пробата и стандарти с неизвестно количество ГМO;
• Провеждане на няколко ПВР със специфични праймери (обикновено за добре известни регулаторни последователности, каквито са например промоторите 35SCaMV или Tnos);
• Визуализиране на ДНК фрагментите в агарозна гел електрофореза;
• Анализ и полу-количествена оценка с помощта на софтуер за изображения.

С помощта на методите на основата на множествена ПВР могат да се скринират и откриват няколко ДНК последователности в рамките на една-единствена реакция. Обаче, разработването на множествен анализ изисква внимателно тестване и потвърждаване. Наличните амплификационни фрагменти трябва да бъдат допълнително анализирани за разграничаване на отделните ампликони. Това може да се осъществи с помощта на специфични хибридизационни сонди в гел електрофореза, като се сравнят фрагментите по размер, или с използване на белязани праймери.

Голямо преимущество на тази техника е фактът, че са необходими по-малък брой реакции за изследване на пробата за наличие на ДНК, произхождаща от ГМO. Ако е необходимо провеждането на допълнителни количествени анализи би било добре да се знае количеството на кои ГМO ще се следи, тъй като процедурата е относително скъпа. Идентификацията на определен ГМО е важна също така и в контекста на нашите познания за одобрените и не-одобрени ГМO.

Друг подход е количественото определяне, на базата на ПВР, което може да бъде осъществено както по време на амплификационния процес (т.нар. ПВР в реално време), така и след приключване на реакцията (ПВР в крайна точка).

Анализите на крайния продукт често се основават на сравнение на количеството на амплифицираната ДНК от две ДНК мишени: едната е тази, чието количество трябва да се определи, а другата е т.нар ‘конкурент’ (в малко, но известно количество), която се добавя в амплификационната смес преди провеждането на реакцията и коамплифицира с мишената, чието количество ще се определя. Този процес се нарича още конкурентна количествена ПВР. Той се основава на презумпцията, че ако и двете ДНК – мишената и конкурента – дадат едно и също количество амплификационен продукт, то и началното количество на тези ДНК молекули се приема за едно и също.

При ПВР анализа в реално време количеството на синтезирания продукт по време на ПВР се определя директно чрез измерване на флуоресценцията. Има търговско достъпни хибридизационни сонди, излъчващи флуоресценция, съответстваща на количеството на синтезираната ДНК. Количеството на синтезирания продукт може да се определи и чрез излъчването на внедрено флуоресцентно багрило, но при този случай не е възможно да се направи разлика между специфичните и неспецифични продукти. Предимство на този метод е, че може да се следи количеството на образуваните продукти в динамика, а също така и да се определи броя на циклите, необходими за получаване на определено количество ПВР продукти.

ПВР в реално време изисква по-сложно и скъпо оборудване, но е по-бърз и по-специфичен метод от конкурентната ПВР.