5.2.1. Μέθοδοι για την ταυτοποίηση στελεχών μικροοργανισμών

Η ταξινομική κατάσταση του ξενιστή μικροοργανισμού θεωρείται εξαιρετικά σημαντικό χαρακτηριστικό από την άποψη της αξιολόγησης του κινδύνου. Ως εκ τούτου, οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για γενετικούς χειρισμούς, πρέπει να εξεταστούν καλά ταξινομικά μέσω σωστής και ακριβούς μεθοδολογίας. Αυτοί πρέπει να χαρακτηριστούν επαρκώς από επιστημονική, παραγωγική άποψη και από την άποψη της ασφάλειας. Επί του παρόντος, τα πλέον ακριβή μέσα για τον σωστό προσδιορισμό της ταξινομικής κατάστασης των μικροοργανισμών είναι η τεχνική ττου DNA / DNA υβριδισμού και ο ορισμός των αλληλουχιών 16S rRNA. Αυτές οι μέθοδοι παρέχουν ζωτικής σημασίας πληροφορίες για την ταξινομική κατάσταση των δοκιμαζόμενων μικροοργανισμών. Αυτή τη στιγμή στην αγορά υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία πρότυπων φυσιολογικών / βιοχημικών μεθόδων για τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται ευρέως. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό στην περιγραφή του στελέχους είναι οι πληροφορίες σχετικά με τις παθογόνες ιδιότητές του.

Μετά την εφαρμογή της διαδικασίας της γενετικής τροποποίησης, το στέλεχος του ΓΤΜ που προκύπτει πρέπει να αντιστοιχεί στα χαρακτηριστικά που προσδιορίζουν την ασφάλεια των μικροοργανισμών ξενιστών. Το νέο στέλεχος θα πρέπει να χαρακτηριστεί μέσω των ίδιων μεθόδων και με την ίδια ακρίβεια, συμπεριλαμβανομένων των φαινοτυπικών και γονοτυπικών χαρακτηριστικών. Αυτή η ακριβής σύγκριση μεταξύ του ξενιστή και του ΓΤΜ μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση υφιστάμενων μοριακών τεχνικών: ανάλυση περιορισμού, Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (SAPD), Πολυμορφισμός στο Μήκος των Ενισχυμένων Τεμαχίων (PDAF), το προφίλ πρωτεΐνης κλπ. Η ανάλυση μπορεί να επεκταθεί και προς την ακολουθία του γονιδιώματος.

Άλλοι σημαντικοί παράγοντες που θα πρέπει να μελετηθούν σε σχέση με την αξιολόγηση του κινδύνου των ΓΤΜ είναι οι εξής:

- η επίδραση της γενετικής τροποποίησης επί των ιδιοτήτων του μικροοργανισμού - ξενιστή:

- η σταθερότητα του γενετικού συστήματος και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά του κατασκευάσματος γονιδίου.

Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά είναι σημαντικά κατά τη διαδικασία αξιολόγησης της ασφάλειας των προϊόντων που προέρχονται από ΓΤΜ και των επιπτώσεών τους στο περιβάλλον.

Οι μέθοδοι για την ταυτοποίηση των στελεχών παραγωγών, των μολυσμένων στελεχών ή των παθογόνων είναι τεχνικές που εφαρμόζονται τόσο στο γενοτυπικό όσο και στο φαινοτυπικό επίπεδο. Οι γονοτυπικές μέθοδοι περιλαμβάνουν τεχνικές όπως η ανάλυση αλληλουχίας του rDNA, η βασική σύνθεση του DNA και η υβριδοποίηση DNA / DNA. Η αλληλουχία του DNA, και ειδικά η ανάλυση αλληλουχίας του rDNA σκοπεύει στην συγκριτική ανάλυση των αλληλουχιών rDNA. Αυτό επιτυγχάνεται με άμεση αλληλούχιση μερών ή σχεδόν ολόκληρης της περιοχής του μορίου 16S rDNA ή 23S με αλυσωτή αντίδραση πολυμερισμού (PCR) χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους εκκινητές.

Η αναλογία των βάσεων του DNA (G + C μοριακό %) είναι μια κλασική γονοτυπική μέθοδος, μέρος της προτύπης περιγραφής των βακτηριακών ταξινομικών βαθμίδων. Η παρατηρούμενη μεταβολή δεν είναι μεγαλύτερη από 3% εντός του είδους και όχι περισσότερο από 10% μέσα σε ένα δεδομένο γένος. Μεταξύ των βακτηρίων D + H το περιεχόμενο κυμαίνεται μεταξύ 24% και 76%.

Ο υβριδισμός DNA / DNA εφαρμόζεται για την ταυτοποίηση σχεδόν όλων των βακτηρίων, καθώς και ενός ευρέως φάσματος ζυμομυκήτων και των μυκήτων.

Όσον αφορά την ταξινομική ανάλυση αυτών των μεθόδων, η ανάλυση αλληλουχίας rDNA και ο προσδιορισμός της βασικής σύνθεσης του DNA είναι χρήσιμη/ος για την ταυτοποίηση του γένους και του είδους, ενώ η τεχνική υβριδισμού DNA / DNA χρησιμοποιείται μόνο για το χαρακτηρισμό σε επίπεδο είδους. Οι γονοτυπικές μέθοδοι είναι κατάλληλη εφαρμογή τόσο σε βακτήρια, όσο και σε ζυμομύκητες και σε πιο περιορισμένο βαθμό σε μύκητες (μόνο η ανάλυση αλληλουχίας rDNA).

Οι φαινοτυπικές μοριακές μέθοδοι περιλαμβάνουν την αφαίρεση «αποτυπωμάτων» των κυτταρικών λιπαρών οξέων και των ηλεκτροφορητικών προφίλ της συνολικής πρωτεΐνης. Αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται κυρίως για τον εντοπισμό των βακτηρίων και ενώ η ανάλυση των λιπαρών οξέων είναι χρήσιμη για την ταυτοποίηση στο επίπεδο του γένους και του είδους, η ηλεκτροφορητική ανάλυση χρησιμοποιείται συνήθως για την ταυτοποίηση των ειδών.