5.2.2. Μέθοδοι τυποποίησης

Βασει των μοριακών βιολογικών τεχνικών DNA, έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι τυποποίησης για τον διαχωρισμό των μεμονωμένων ειδών, καθώς και προϊόντων απομόνωσης ενός δεδομένου είδους. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από αυτές τις μεθόδους παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την κατανομή και την παρουσία μικροοργανισμών, που αλλοιώνουν τα τρόφιμα ή σχετικά με παθογόνους μικρορογανσιμούς, όχι μόνο στα τρόφιμα, αλλά και στο περιβάλλον. Έτσι, οι μέθοδοι με βάση το DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για επιδημιολογικούς σκοπούς και είναι χρήσιμα στη διαφοροποίηση μεταξύ ταυτόχρονων αλλά ανεξάρτητων λοιμώξεων, και επιδημιών που προκαλούνται από ένα μόνο προϊόν απομόνωσης. Το γεγονός αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία, δεδομένου ότι μπορεί να διευκολύνει την εφαρμογή μέτρων πρόληψης και υγιεινής.

Οι γονοτυπικές μέθοδοι συνήθως κατηγοριοποιούνται ανάλογα με τις τεχνικές πτυχές της εφαρμογής τους. Σύμφωνα με το κριτήριο αυτό μπορούμε να απαριθμήσουμε τις εξής σημαντικές μεθόδους:

• αλληλουχία DNA,
• Ανάλυση περιοριστικών προφίλ ενδονουκλεάσης του DNA πλασμιδίου και / ή γονιδιωματικού DNA (Π.χ. Πολυμορφισμός στο Μήκος των Θραύσματων Περιορισμού (RFLP) Ηλεκτροφόρηση Πήγματος Παλλόμενου Πεδίου (PGE)),
• Τεχνικές βασισμένες σε καθετήρες (μέθοδοι επισήμανσης),
• Τεχνικές βασισμένες σε PCR (μέθοδοι ενίσχυσης όπως Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD) και Πολυμορφισμός στο Μήκος των Ενισχυμένων Θραυσμάτων (RFLP)).

Πολυμορφισμός στο Μήκος των Θραυσμάτων Περιορισμού (RFLP). Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην φυσική μεταβλητότητα των μορίων του DNA (χρωμοσωμικό, πλασμιδιακό και μιτοχονδριακό DNA στα ευκαρυωτικά) σε σχέση με τη θέση και τον αριθμό των αλληλουχιών 6 έως 8 διαστάσεων κατά μήκος αυτού του μορίου. Η διάσπαση αυτού του DNA με ενδονουκλεάση περιορισμού οδηγεί στο σχηματισμό θραυσμάτων διαφορετικού μήκους, τα οποία μπορούν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης (AGE) και να οπτικοποιηθούν άμεσα μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο (στην περίπτωση ενός περιορισμένου αριθμού θραυσμάτων, π.χ. μικρότερου από 50) ή μετά από υβριδισμό με έναν ειδικά σημειώμένο καθετήρα.

Η ηλεκτροφόρηση πήγματος παλλόμενου πεδίου (PGE) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μεγάλων μορίων DNA, όπως χρωμοσωμάτων. Αυτή μπορεί να εφαρμοστεί επίσης για τον διαχωρισμό μεγάλων θραυσμάτων DNA που λαμβάνονται μετά τη διάσπαση με τις λεγόμενες σπανίως κόβοντες ενδονουκλεάσες περιορισμού, τα οποία δημιουργούν έναν περιορισμένο αριθμό τεμαχίων. Λόγω του υψηλού βαθμού του πολυμορφισμού τα χρωμοσώματα / τα μεγάλα θραύσματα DNA είναι πολύ χρήσιμα για την ταυτοποίηση των ειδών.

Τεχνικές που βασίζονται σε καθετήρες (μέθοδοι επισήμανσης). Αυτές οι μέθοδοι αφορούν την ένταξη / τή σύνδεση ενός εννουκλεϊκού οξέος στο άκρο ενός ιχνιλάτη. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της βασικής διαδικασίας σύμφωνα με μια ποικιλία παραγόντων. Όσον αφορά τον τύπο του νουκλεϊνικού οξέος, το μέγεθος και την ποσότητά του, μπορούμε να απαριθμήσουμε 4 μέθοδους σήμανσης: σήμανση σε 3 και 5 άκρα, τυχαία σήμανση μέσω nick-translation και σήμανση με τυχαία εναύσματα. Όσον αφορά τo μόριο σήμανσης, δηλ. τη φύση της, μπορεί να χρησιμοποιηθούν τόσο ραδιενεργές, όσο και μη ραδιενεργές μεθόδοι. Στη ραδιενεργή σήμανση ανιχνεύονται τα ραδιοϊσότοπα μέσω αυτοραδιογραφίας, ενώ η μη ραδιενεργή σήμανση χρησιμοποιεί φθορισμό, χημιφωταύγεια ή ενζυμικές αντιδράσεις.

Τεχνικές που βασίζονται στην PCR (μέθοδοι ενίσχυσης). Σε εκείνες τις μεθόδους χρησιμοποιείται in vitro ενζυματική ενίσχυση μίας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων για την εξακρίβωση της ταυτότητας των ειδών. Τόσο η βασική μέθοδος της PCR, όσο και οι τροποποιήσεις του χρησιμεύσουν ως ισχυρά εργαλεία για την ενίσχυση των αλληλουχιών DNA από στελέχη παραγωγής, ριπογόνα στελέχη και παθογόνα στελέχη, για την ανίχνευση και τυποποίηση τους. Μεταξύ της ευρείας ποικιλίας μεθόδων που βασίζονται στην PCR και σκοπεύουν στην απ‘ευθείας ταυτοποίηση ενός οργανισμού σε ένα προϊόν διατροφής, οι μέδοδοι που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι οι αναλύσεις SAPD και PDAF.

Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD) είναι μια τεχνική PCR του λεγόμενου τυχαίου τύπου, με βάση την ενίσχυση μιας περιοχής του DNA, για την οποία δεν υπάρχουν προηγούμενες πληροφορίες για οποιαδήποτε αλληλουχία - στόχο. Διατάσσοντας τυχαία εκκινητές 10 διαστάσεων και με την εφαρμογή ενίσχυσης σε πλημμελή έλεγχο των παραμέτρων ενίσχυσης, μπορούμε να αποκτήσουμε ένα σύνολο τεμαχίων (ενισχυμένα θραύσματα), που είναι κατ’αρχήν συγκεκριμένο από άποψη είδους. Το γεγονός αυτό συμβάλλει στην εφαρμογή του RAPD - PCR ως αξιόπιστη μέθοδος διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών των μικροοργανισμών.

Πολυμορφισμός στο Μήκος των Ενισχυμένων Θραυσμάτων (AFLP). Αυτή είναι μια ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδος για την ανίχνευση του πολυμορφισμού μεταξύ των ατόμων, που εφαρμόζεται τόσο για τη διαφοροποίηση εντός των ειδών, όσο και για τη διαφοροποίηση μεταξύ των ειδών. Αυτός είναι ένας AFLP με τη μεσολάβηση PCR, επιλεγμένων θραυσμάτων DNA σε ένα ευρύ φάσμα θραυσμάτων DNA. Ο AFLP διαλέγει για πολυμορφισμό στο μήκος των ενισχυμένών θραυσμάτων μεσω επιλεκτικής ενίσχυσης μερικών από αυτά. Η μέθοδος περιλαμβάνει άλεση του γονιδιωματικού DNA με δύο ενδονουκλεάσες περιορισμού, που ακολουθείται από PCR ενίσχυση των προκυπτόντων θραυσμάτων. Τα θραύσματα περιορισμού τροποποιούνται εκ των προτέρων με αλληλουχίες προσαρμογέα που είναι ειδικές για τις ενδονουκλεάσες που χρησιμο-ποιούνται, οι οποίες χρησιμεύουν έτσι ως θέσεις πρόσδεσης με τους εκκινητές. Οι ίδιοι οι εκκινητές είναι διατεταγμένοι κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να επιτρέπουν πολύ ειδική ενίσχυση, λόγω του γεγονότος ότι ενισσχύονται μόνο τα θραύσματα που αντιστοιχούν εντελώς στις αλληλουχίες των εκκινητών.