5.2. Μοριακές μέθοδοι για τον έλεγχο των γενετικά τροποποιημένων τροφίμων

5.2.1. Μέθοδοι για την ταυτοποίηση στελεχών μικροοργανισμών

Η ταξινομική κατάσταση του ξενιστή μικροοργανισμού θεωρείται εξαιρετικά σημαντικό χαρακτηριστικό από την άποψη της αξιολόγησης του κινδύνου. Ως εκ τούτου, οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται για γενετικούς χειρισμούς, πρέπει να εξεταστούν καλά ταξινομικά μέσω σωστής και ακριβούς μεθοδολογίας. Αυτοί πρέπει να χαρακτηριστούν επαρκώς από επιστημονική, παραγωγική άποψη και από την άποψη της ασφάλειας. Επί του παρόντος, τα πλέον ακριβή μέσα για τον σωστό προσδιορισμό της ταξινομικής κατάστασης των μικροοργανισμών είναι η τεχνική ττου DNA / DNA υβριδισμού και ο ορισμός των αλληλουχιών 16S rRNA. Αυτές οι μέθοδοι παρέχουν ζωτικής σημασίας πληροφορίες για την ταξινομική κατάσταση των δοκιμαζόμενων μικροοργανισμών. Αυτή τη στιγμή στην αγορά υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία πρότυπων φυσιολογικών / βιοχημικών μεθόδων για τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται ευρέως. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό στην περιγραφή του στελέχους είναι οι πληροφορίες σχετικά με τις παθογόνες ιδιότητές του.

Μετά την εφαρμογή της διαδικασίας της γενετικής τροποποίησης, το στέλεχος του ΓΤΜ που προκύπτει πρέπει να αντιστοιχεί στα χαρακτηριστικά που προσδιορίζουν την ασφάλεια των μικροοργανισμών ξενιστών. Το νέο στέλεχος θα πρέπει να χαρακτηριστεί μέσω των ίδιων μεθόδων και με την ίδια ακρίβεια, συμπεριλαμβανομένων των φαινοτυπικών και γονοτυπικών χαρακτηριστικών. Αυτή η ακριβής σύγκριση μεταξύ του ξενιστή και του ΓΤΜ μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση υφιστάμενων μοριακών τεχνικών: ανάλυση περιορισμού, Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (SAPD), Πολυμορφισμός στο Μήκος των Ενισχυμένων Τεμαχίων (PDAF), το προφίλ πρωτεΐνης κλπ. Η ανάλυση μπορεί να επεκταθεί και προς την ακολουθία του γονιδιώματος.

Άλλοι σημαντικοί παράγοντες που θα πρέπει να μελετηθούν σε σχέση με την αξιολόγηση του κινδύνου των ΓΤΜ είναι οι εξής:

- η επίδραση της γενετικής τροποποίησης επί των ιδιοτήτων του μικροοργανισμού - ξενιστή:

- η σταθερότητα του γενετικού συστήματος και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά του κατασκευάσματος γονιδίου.

Όλα αυτά τα χαρακτηριστικά είναι σημαντικά κατά τη διαδικασία αξιολόγησης της ασφάλειας των προϊόντων που προέρχονται από ΓΤΜ και των επιπτώσεών τους στο περιβάλλον.

Οι μέθοδοι για την ταυτοποίηση των στελεχών παραγωγών, των μολυσμένων στελεχών ή των παθογόνων είναι τεχνικές που εφαρμόζονται τόσο στο γενοτυπικό όσο και στο φαινοτυπικό επίπεδο. Οι γονοτυπικές μέθοδοι περιλαμβάνουν τεχνικές όπως η ανάλυση αλληλουχίας του rDNA, η βασική σύνθεση του DNA και η υβριδοποίηση DNA / DNA. Η αλληλουχία του DNA, και ειδικά η ανάλυση αλληλουχίας του rDNA σκοπεύει στην συγκριτική ανάλυση των αλληλουχιών rDNA. Αυτό επιτυγχάνεται με άμεση αλληλούχιση μερών ή σχεδόν ολόκληρης της περιοχής του μορίου 16S rDNA ή 23S με αλυσωτή αντίδραση πολυμερισμού (PCR) χρησιμοποιώντας τους κατάλληλους εκκινητές.

Η αναλογία των βάσεων του DNA (G + C μοριακό %) είναι μια κλασική γονοτυπική μέθοδος, μέρος της προτύπης περιγραφής των βακτηριακών ταξινομικών βαθμίδων. Η παρατηρούμενη μεταβολή δεν είναι μεγαλύτερη από 3% εντός του είδους και όχι περισσότερο από 10% μέσα σε ένα δεδομένο γένος. Μεταξύ των βακτηρίων D + H το περιεχόμενο κυμαίνεται μεταξύ 24% και 76%.

Ο υβριδισμός DNA / DNA εφαρμόζεται για την ταυτοποίηση σχεδόν όλων των βακτηρίων, καθώς και ενός ευρέως φάσματος ζυμομυκήτων και των μυκήτων.

Όσον αφορά την ταξινομική ανάλυση αυτών των μεθόδων, η ανάλυση αλληλουχίας rDNA και ο προσδιορισμός της βασικής σύνθεσης του DNA είναι χρήσιμη/ος για την ταυτοποίηση του γένους και του είδους, ενώ η τεχνική υβριδισμού DNA / DNA χρησιμοποιείται μόνο για το χαρακτηρισμό σε επίπεδο είδους. Οι γονοτυπικές μέθοδοι είναι κατάλληλη εφαρμογή τόσο σε βακτήρια, όσο και σε ζυμομύκητες και σε πιο περιορισμένο βαθμό σε μύκητες (μόνο η ανάλυση αλληλουχίας rDNA).

Οι φαινοτυπικές μοριακές μέθοδοι περιλαμβάνουν την αφαίρεση «αποτυπωμάτων» των κυτταρικών λιπαρών οξέων και των ηλεκτροφορητικών προφίλ της συνολικής πρωτεΐνης. Αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται κυρίως για τον εντοπισμό των βακτηρίων και ενώ η ανάλυση των λιπαρών οξέων είναι χρήσιμη για την ταυτοποίηση στο επίπεδο του γένους και του είδους, η ηλεκτροφορητική ανάλυση χρησιμοποιείται συνήθως για την ταυτοποίηση των ειδών.

5.2.2. Μέθοδοι τυποποίησης

Βασει των μοριακών βιολογικών τεχνικών DNA, έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι τυποποίησης για τον διαχωρισμό των μεμονωμένων ειδών, καθώς και προϊόντων απομόνωσης ενός δεδομένου είδους. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από αυτές τις μεθόδους παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την κατανομή και την παρουσία μικροοργανισμών, που αλλοιώνουν τα τρόφιμα ή σχετικά με παθογόνους μικρορογανσιμούς, όχι μόνο στα τρόφιμα, αλλά και στο περιβάλλον. Έτσι, οι μέθοδοι με βάση το DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για επιδημιολογικούς σκοπούς και είναι χρήσιμα στη διαφοροποίηση μεταξύ ταυτόχρονων αλλά ανεξάρτητων λοιμώξεων, και επιδημιών που προκαλούνται από ένα μόνο προϊόν απομόνωσης. Το γεγονός αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία, δεδομένου ότι μπορεί να διευκολύνει την εφαρμογή μέτρων πρόληψης και υγιεινής.

Οι γονοτυπικές μέθοδοι συνήθως κατηγοριοποιούνται ανάλογα με τις τεχνικές πτυχές της εφαρμογής τους. Σύμφωνα με το κριτήριο αυτό μπορούμε να απαριθμήσουμε τις εξής σημαντικές μεθόδους:

• αλληλουχία DNA,
• Ανάλυση περιοριστικών προφίλ ενδονουκλεάσης του DNA πλασμιδίου και / ή γονιδιωματικού DNA (Π.χ. Πολυμορφισμός στο Μήκος των Θραύσματων Περιορισμού (RFLP) Ηλεκτροφόρηση Πήγματος Παλλόμενου Πεδίου (PGE)),
• Τεχνικές βασισμένες σε καθετήρες (μέθοδοι επισήμανσης),
• Τεχνικές βασισμένες σε PCR (μέθοδοι ενίσχυσης όπως Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD) και Πολυμορφισμός στο Μήκος των Ενισχυμένων Θραυσμάτων (RFLP)).

Πολυμορφισμός στο Μήκος των Θραυσμάτων Περιορισμού (RFLP). Αυτή η μέθοδος βασίζεται στην φυσική μεταβλητότητα των μορίων του DNA (χρωμοσωμικό, πλασμιδιακό και μιτοχονδριακό DNA στα ευκαρυωτικά) σε σχέση με τη θέση και τον αριθμό των αλληλουχιών 6 έως 8 διαστάσεων κατά μήκος αυτού του μορίου. Η διάσπαση αυτού του DNA με ενδονουκλεάση περιορισμού οδηγεί στο σχηματισμό θραυσμάτων διαφορετικού μήκους, τα οποία μπορούν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης (AGE) και να οπτικοποιηθούν άμεσα μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο (στην περίπτωση ενός περιορισμένου αριθμού θραυσμάτων, π.χ. μικρότερου από 50) ή μετά από υβριδισμό με έναν ειδικά σημειώμένο καθετήρα.

Η ηλεκτροφόρηση πήγματος παλλόμενου πεδίου (PGE) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό μεγάλων μορίων DNA, όπως χρωμοσωμάτων. Αυτή μπορεί να εφαρμοστεί επίσης για τον διαχωρισμό μεγάλων θραυσμάτων DNA που λαμβάνονται μετά τη διάσπαση με τις λεγόμενες σπανίως κόβοντες ενδονουκλεάσες περιορισμού, τα οποία δημιουργούν έναν περιορισμένο αριθμό τεμαχίων. Λόγω του υψηλού βαθμού του πολυμορφισμού τα χρωμοσώματα / τα μεγάλα θραύσματα DNA είναι πολύ χρήσιμα για την ταυτοποίηση των ειδών.

Τεχνικές που βασίζονται σε καθετήρες (μέθοδοι επισήμανσης). Αυτές οι μέθοδοι αφορούν την ένταξη / τή σύνδεση ενός εννουκλεϊκού οξέος στο άκρο ενός ιχνιλάτη. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της βασικής διαδικασίας σύμφωνα με μια ποικιλία παραγόντων. Όσον αφορά τον τύπο του νουκλεϊνικού οξέος, το μέγεθος και την ποσότητά του, μπορούμε να απαριθμήσουμε 4 μέθοδους σήμανσης: σήμανση σε 3 και 5 άκρα, τυχαία σήμανση μέσω nick-translation και σήμανση με τυχαία εναύσματα. Όσον αφορά τo μόριο σήμανσης, δηλ. τη φύση της, μπορεί να χρησιμοποιηθούν τόσο ραδιενεργές, όσο και μη ραδιενεργές μεθόδοι. Στη ραδιενεργή σήμανση ανιχνεύονται τα ραδιοϊσότοπα μέσω αυτοραδιογραφίας, ενώ η μη ραδιενεργή σήμανση χρησιμοποιεί φθορισμό, χημιφωταύγεια ή ενζυμικές αντιδράσεις.

Τεχνικές που βασίζονται στην PCR (μέθοδοι ενίσχυσης). Σε εκείνες τις μεθόδους χρησιμοποιείται in vitro ενζυματική ενίσχυση μίας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων για την εξακρίβωση της ταυτότητας των ειδών. Τόσο η βασική μέθοδος της PCR, όσο και οι τροποποιήσεις του χρησιμεύσουν ως ισχυρά εργαλεία για την ενίσχυση των αλληλουχιών DNA από στελέχη παραγωγής, ριπογόνα στελέχη και παθογόνα στελέχη, για την ανίχνευση και τυποποίηση τους. Μεταξύ της ευρείας ποικιλίας μεθόδων που βασίζονται στην PCR και σκοπεύουν στην απ‘ευθείας ταυτοποίηση ενός οργανισμού σε ένα προϊόν διατροφής, οι μέδοδοι που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι οι αναλύσεις SAPD και PDAF.

Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD) είναι μια τεχνική PCR του λεγόμενου τυχαίου τύπου, με βάση την ενίσχυση μιας περιοχής του DNA, για την οποία δεν υπάρχουν προηγούμενες πληροφορίες για οποιαδήποτε αλληλουχία - στόχο. Διατάσσοντας τυχαία εκκινητές 10 διαστάσεων και με την εφαρμογή ενίσχυσης σε πλημμελή έλεγχο των παραμέτρων ενίσχυσης, μπορούμε να αποκτήσουμε ένα σύνολο τεμαχίων (ενισχυμένα θραύσματα), που είναι κατ’αρχήν συγκεκριμένο από άποψη είδους. Το γεγονός αυτό συμβάλλει στην εφαρμογή του RAPD - PCR ως αξιόπιστη μέθοδος διαφοροποίησης μεταξύ των πληθυσμών των μικροοργανισμών.

Πολυμορφισμός στο Μήκος των Ενισχυμένων Θραυσμάτων (AFLP). Αυτή είναι μια ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδος για την ανίχνευση του πολυμορφισμού μεταξύ των ατόμων, που εφαρμόζεται τόσο για τη διαφοροποίηση εντός των ειδών, όσο και για τη διαφοροποίηση μεταξύ των ειδών. Αυτός είναι ένας AFLP με τη μεσολάβηση PCR, επιλεγμένων θραυσμάτων DNA σε ένα ευρύ φάσμα θραυσμάτων DNA. Ο AFLP διαλέγει για πολυμορφισμό στο μήκος των ενισχυμένών θραυσμάτων μεσω επιλεκτικής ενίσχυσης μερικών από αυτά. Η μέθοδος περιλαμβάνει άλεση του γονιδιωματικού DNA με δύο ενδονουκλεάσες περιορισμού, που ακολουθείται από PCR ενίσχυση των προκυπτόντων θραυσμάτων. Τα θραύσματα περιορισμού τροποποιούνται εκ των προτέρων με αλληλουχίες προσαρμογέα που είναι ειδικές για τις ενδονουκλεάσες που χρησιμο-ποιούνται, οι οποίες χρησιμεύουν έτσι ως θέσεις πρόσδεσης με τους εκκινητές. Οι ίδιοι οι εκκινητές είναι διατεταγμένοι κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να επιτρέπουν πολύ ειδική ενίσχυση, λόγω του γεγονότος ότι ενισσχύονται μόνο τα θραύσματα που αντιστοιχούν εντελώς στις αλληλουχίες των εκκινητών.

5.2.3. Μέθοδοι για την ανίχνευση και την παρακολούθηση των στελεχών

Εδώ εεφαρμόσιμες ισχύουν μόνο οι γονοτυπικές μέθοδοι, δηλαδή όλες οι τεχνικές τυποποίησης που αναφέρονται παραπάνω, με ιδιαίτερη έμφαση στην επισήμανση του DNA, η ισχυρή ανάλυση της οποίας επιτρέπει τη δυνατότητα ανίχνευσης στο επίπεδο του γένους, του είδους και του στελέχους στα βακτήρια, τους ζυμομύκητες και τους μύκητες.