5.3.5. Μέθοδοι που βασίζονται σε DNA - ενίσχυση με PCR

Μέθοδοι που βασίζονται σε DNA, στηρίζονται στον πολλαπλασιασμό ενός συγκεκριμένου τμήματος του μορίου του DNA με την τεχνική PCR. Για την οπτικοποίηση των προϊόντων ενίσχυσης τυπικά χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση πήγματος. Αυτή μπορεί να πραγματοποιηθεί ανεξάρτητα ή να συνδεθεί με άλεση ενδονουκλεάσης (RFLP-PCR). Μια πιο εξελιγμένη εκδοχή του βασικού πρωτόκολλου PCR περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του προφίλ Tm μέσω της εισαγωγής βαφών στη διπλή αλυσίδα του DNA και εκπομπής φθορίζοντος φωτός. Με την αύξηση της θερμοκρασίας οι δύο αλυσίδες του DNA αρχίζουν να διαχωρίζουν και συνεπώς το εκπεμπόμενο φως που μπορεί να μετρηθεί είναι μειωμένο. Tm είναι πολύ πιο ειδικό χαρακτηριστικό των αλληλουχιών DNA σε σύγκριση με το μήκος του DNA. Μια άλλη επιλογή είναι η χρήση ανιχνευτών και η διεξαγωγή υβριδισμού με DNA ή RNA. Εάν κατασκευαστεί ένας κατάλληλος καθετήρας, αυτός θα μπορούσε να διαφοροποιήσει τη φυσικές από τις ξένες ακολουθίες. Η σήμανση του ανιχνευτή με ραδιενεργές ή μη ραδιενεργές ενώσεις μπορεί να διευκολύνει την ανίχνευση των μορίων. Επί του παρόντος, οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες τεχνικές για την ανάλυση των ΓΤΟ είναι η ηλεκτροφόρηση πηκτώματος και η υβριδοποίηση.

Η διαλογή δειγμάτων τροφίμων για την παρουσία ΓΤΟ, χρησιμοποιώντας το βασικό πρωτόκολλο της PCR περιλαμβάνει τις ακόλουθες διαδικασίες:

• Εξαγωγή του DNA από το δείγμα και πρότυπα με άγνωστη ποσότητα των ΓΤΟ,
• Διεξαγωγή αρκετών PCR με ειδικούς εκκινητές (συνήθως για πολύ καλά γνωστές ρυθμιστικές αλληλουχίες, όπως για παράδειγμα οι προαγωγοί 35SCaMV ή Tnos),
• Η οπτικοποίηση των θραυσμάτων του DNA σε ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης,
• Ανάλυση και ημι-ποσοτική αξιολόγηση με τη χρήση λογισμικού απεικόνησης.

Με τη χρήση των μεθόδων που βασίζονται σε πολλαπλή PCR μπορούν να υποβληθούν σε διαλογή και να ανιχνευθούν πολλαπλές ακολουθίες DNA εντός μιάς μόνο αντίδρασης. Ωστόσο, η ανάπτυξη πολλαπλής ανάλυσης απαιτεί προσεκτική δοκιμή και επικύρωση. Τα διαθέσιμα θραύσματα ενίσχυσης θα πρέπει να αναλυθούν περαιτέρω για να διακριθούν τα μεμονωμένα προϊόντα ενίσχυσης. Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές υβριδισμού σε ηλεκτροφόρηση πηκτώματος με τη σύγκριση των θραυσμάτων ως προς το μέγεθος, ή με τη χρήση επισημασμένων εκκινητών.

Ένα μεγάλο πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι το γεγονός ότι είναι αναγκαίος μικρότερος αριθμός αντιδράσεων για την εξέταση του δείγματος για την παρουσία DNA που προέρχεται από ΓΤΟ. Εάν είναι αναγκαία η διεξαγωγή πρόσθετης ποσοτικής ανάλυσης, θα ήταν καλό να γνωρίζουμε η ποσότητα ποιών ΓΤΟ θα παρακολουθείται, επειδή η διαδικασία είναι σχετικά ακριβή. Ο προσδιορισμός συγκεκριμένου ΓΤΟ είναι επίσης σημαντικός στο πλαίσιο της γνώσης μας για εγκεκριμένους και μη εγκεκριμένους ΓΤΟ.

Μια άλλη προσέγγιση είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός, με βάση την PCR, ο οποίος μπορεί να πραγματοποιηθεί τόσο κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης (η λεγομενη PCR σε πραγματικό χρόνο), και μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης (PCR σε τελικό σημείο).

Οι αναλύσεις του τελικού προϊόντος συχνά βασίζονται σε μια σύγκριση της ποσότητας του ενισχυμένου DNA από δύο στόχους DNA: ο ένας είναι εκείνος, η ποσότητα του οποίου πρόκειται να προσδιοριστεί, και ό άλλος είναι ο λεγόμενος «ανταγωνιστής» (σε μια μικρή αλλά γνωστή ποσότητα), ο οποίος προστίθεται στο μίγμα της ενίσχυσης πριν από την αντίδραση και συν-ενισχύεται με τον στόχο του οποίου η ποσότητα θα πρέπει να καθοριστεί. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται επίσης ανταγωνιστική ποσοτική PCR. Αυτή βασίζεται στην υπόθεση ότι αν και οι δύο DNA - ο στόχος και ο ανταγωνιστής - δίνουν την ίδια ποσότητα προϊόντος ενίσχυσης, τότε το αρχικό ποσό αυτών των μορίων DNA θεωρείται το ίδιο.

Στην ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο, το ποσό του συντεθέντος προϊόντος κατά τη διάρκεια της PCR προσδιορίζεται απευθείας μέσω μέτρησης του φθορισμού. Υπάρχουν διαθέσιμοι στο εμπόριο ανιχνευτές υβριδισμού που εκπέμπουν φθορισμό, που αντιστοιχεί στο ποσό του συντεθέντος DNA. Η ποσότητα του προϊόντος που συντίθεται μπορεί να προσδιοριστεί και από την εκπομπή μιας φθορίζουσα χρωστικής ουσίας, αλλά στην περίπτωση αυτή δεν είναι δυνατόν να γίνει διάκριση μεταξύ των ειδικών και των μη-ειδικών προϊόντων. Ένα πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μπορεί να παρακολουθείται η ποσότητα των προϊόντων που σχηματίζονται σε εξέλιξη, και επίσης να καθοριστεί ο αριθμός των κύκλων που απαιτούνται για τη λήψη μιας συγκεκριμένης ποσότητας των προϊόντων PCR.

Η PCR σε πραγματικό χρόνο απαιτεί έναν πιο πολύπλοκο και ακριβό εξοπλισμό, αλλά είναι ταχύτερη και πιο συγκεκριμένη μέθοδος από την ανταγωνιστική PCR.