5.1. Τεχνικές για την γενετική τροποποίηση μικροοργανισμών

 5.1.1. Κλασικές μέθοδοι

Η κλασικές μέθοδοι για γονιδιωματική τροποποίηση των μικροοργανισμών χωρίζονται σε δύο τύπους:

• Η επιλογή μεταλλάξεων που προκύπτουν αυθόρμητα, και που προκαλούνται από διάφορους φυσικούς και χημικούς παράγοντες του περιβάλλοντος. Οι αυθόρμητες μεταλλάξεις είναι συνέπεια της ανακατάταξης της κληρονομικού μορίου DNA λόγω αντικατάστασης ενός νουκλεοτιδίου από ένα άλλο, της προσθήκης ή διαγραφής ενός ή περισσοτέρων νουκλεοτιδίων, ή λόγω άλλων τύπων μεταρρυθμίσεων. Μεγάλος αριθμός των αυθόρμητων μεταλλακτών προκύπτουν λόγω της κίνησης των μεταθετών στοιχείων σε νέες θέσεις στο δίκλωνο DNA. Τέτοια στοιχεία είναι τυπικά για τα φυτά, τα ζώα και τα μικρόβια.
• Η ανταλλαγή DNA μεταξύ στενά συγγενικών οργανισμών. Αυτός ο τύπος τροποποίησης γονιδίου στους μικροοργανισμούς είναι η εισαγωγή νέων γενετικών πληροφοριών μέσω χρωμοσωμικού DNA ή DNA πλασμιδίου. Αυτό το γεγονός συμβαίνει όταν το DNA από το χρωμόσωμα του μικροοργανισμού δότη ενσωματωθεί στο DNA του λήπτη. Επειδή είναι αυτοαντιγραφόμενα, τα πλασμίδια μεταφέρουν το DNA από τον δότη στον λήπτη χωρίς ενσωμάτωση στο χρωμοσωμικό DNA. Με τον τρόπο αυτό, το DNA του πλασμιδίου μπορεί να μεταφερθεί σε οργανισμούς που διαφέρουν πολύ, σε σύγκριση με το δότη. Η κίνηση του πλασμιδίου μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί λόγω του δείκτη που περιέχεται στο μόριό του (π.χ. ανθεκτκότητα σε αντιβιοτικά). Τρεις διαφορετικοί κλασικοί τύποι της μεταφοράς γονιδίων είναι χαρακτηριστικοί για τα βακτήρια. Θεωρείται ότι αυτοί συμβαίνουν στη φύση:
  • Μετασχηματισμός που σχετίζεται με το DNA (το DNA μεταφέρεται ως «γυμνό» DNA)
  • Μεταγωγή - η μεταφορά του DNA διεξάγεται μέσω ιού
  • Σύζευξη – το DNA μεταφέρεται κατά τη διάρκεια της επαφής των κυττάρων μεταξύ των κυττάρων το δότη και του λήπτη.

5.1.2. Μοριακές τεχνικές

Η σύγχρονη εξέληξη της μοριακής τεχνολογίας στις μεθόδους μεταλλαξιγένεσης και μεταφοράς γονιδίων, αυξάνει σημαντικά το φάσμα των μικροοργανισμών που υπόκεινται σε μεταφορά DNA από οργανισμούς που δεν έχουν στενσυγγένεια. Το φράγμα της οικογένειας και το βασιλείου δεν είναι πλέον ανυπέρβλητη περίσταση.

Οι σύγχρονες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στα βακτήρια επιτρέπουν την ολοκλήρωση του ανασυνδυασμένου κατασκευάσματος σε συγκεκριμένες θέσεις του χρωμοσώματος ή των πλασμιδίων. Ωστόσο, οι διαδικασίες για την τροποποίηση των γονιδίων πρέπει να αξιολογηθούν από την άποψη της ασφάλειας τους. Για το λόγο αυτό, το θέμα της συζήτησης είναι τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: τα χαρακτηριστικά του ξενιστή μικροοργανισμού σε σχέση με το γονίδιο (τα γονίδια) που συμπεριλήφθηκαν, τα χαρακτηριστικά του φορέα και του κατασκευάσματος, οι μέθοδοι μεταφοράς DNA.

Όταν τα βακτήρια χρησιμοποιούνται ως μικροοργανισμοί ξενιστές, η διαδικασία για την αξιολόγηση του κινδύνου απαιτεί αποδείξεις για την ασφαλή κατανάλωση αυτού του μικροοργανισμού ως τρόφιμο ή ως συστατικό των τροφίμων. Εάν η απαίτηση αυτή δεν ικανοποιείται, η ασφάλεια του ξενιστή πρέπει να διερευνηθεί και να τεκμηριωθεί. Όταν ο ξενιστής είναι ευκαρυωτικό κύτταρο, εφαρμόζονται οι ίδιες σκέψεις. Το εισαγόμενο γονίδιο (-α) μπορεί να προέρχεται από τον ίδιο μικροβιακό τύπο ή από εξελικτικά πιο μακρινό οργανισμό. Το ένθετο προϊόν του γονιδίου πρέπει να έχει ένα ιστορικό ασφαλούς χρήσης στα τρόφιμα και πρέπει να αποδειχθεί η ασφάλειά του. Όσο πιο μικρό είναι το εισαγόμενο θραύσμα του DNA, τόσο πιο μειωμένη / απλοποιημένη θα είναι η διαδικασία αξιολόγησης της ασφάλεια των τροφίμων.

Όσον αφορά τα χαρακτηριστικά του φορέα και του κατασκευάσματος - εάν ο φορέας χρησιμοποιείται ως τμήμα του γονιδιώματος του ΓΤΜ, η όλη ακολουθία DNA πρέπει να χαρακτηριστεί, συμπεριλαμβανομένων των ρεπλικονίων, των προαγωγών, των επιλέξιμων δεικτών, των συνδετήρων, καθώς και κάθε άλλο κομμάτι του DNA. Ο φορέας πρέπει να περιέχει μια νουκλεοτιδική αλληλουχία των μικροοργανισμών με ιστορικό ασφαλούς χρήσης στα τρόφιμα. Οι επιλεκτικοί δείκτες πρέπει να επιλέγονται πολύ αυστηρά βάσει της ασφαλούς χρήσης και πρέπει να αποφεύγεται οι δείκτες για την ανθενκτικότητα στα αντιβιοτικά. Ωστόσο, εάν αυτοί χρησιμοποιούνται, πρέπει να εφαρμοστούν ειδικές μέθοδοι για το διαχωρισμό τους από το γονιδίωμα του ΓΤΜ (π.χ. ειδική ακολουθία ανασυνδιασμού). Στα ευκαρυωτικά δημιουργούνται ειδικές φορείς κλωνοποίησης, όπως κεντρομερικά πλασμίδια, τεχνητά χρωμοσώματα ζυμομυκήτων, πλασμίδια με βάση τους παράγοντες «δολοφόνους» κλπ.

Όταν μιλάμε για τη μεταφορά DNA, υπάρχει μια απαίτηση για τη χρήση των μεθόδων φυσικής, χημικής και βιολογικής φύσης, που να ελαχιστοποιήσουν τις μεγάλες γενετικές ανακατατάξεις στο γονιδίωμα του ξενιστή. Κατά τη χρήση φορέων ενσωμάτωσης, η αλληλουχία νουκλεοτιδίων των πλευρικών περιοχών στη θέση ενσωμάτωσης στο χρωμόσωμα πρέπει να χαρακτηριστεί.

Οι πληροφορίες αυτές είναι απαραίτητες για την πρόβλεψη του κινδύνου από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται. Στα ευκαρυωτικά, υπάρχουν ορισμένες μέθοδοι για την άμεση ενσωμάτωση των in vitro τροποποιημένων ή δημιουργημένων κατασκευάσματων γονιδίων σε συγκεκριμένες χρωμοσωμικές θέσεις και για τη διαγραφή των γονιδίων που χρησιμοποιούνται σε ορισμένα είδη. Με βάση αυτές τις μεθόδους, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά κατασκευάσματα οι οποίες είναι πολύ σταθερές κατά τον αγενή πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Υπάρχει επίσης η δυνατότητα ανασυνδυασμού μέσω mating με παρόμοια στελέχη της ίδιας μικροχλωρίδας. Όταν τα γενετικά χαρακτηριστικά του στελέχους που χρησιμοποιείται δεν είναι πολύ γνωστά, οι ανεπαρκείς πληροφορίες σχετικά με τα πιθανά γεγονότα ανασυνδυασμού καθιστά αδύνατη την πρόβλεψη του μηχανισμού και της θέσης ένταξης των ξένων γονιδίων. Έτσι, είναι δυνατόν η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται για γενετικό χειρισμό των ζυμομυκήτων και νηματοειδών μυκήτων να επιτρέπει την ενσωμάτωση σε μεταβλητούς χώρους που προκαλούν την εμφάνιση διαφόρων βιοτεχνολογικών ιδιοτήτων και γενετικής αστάθειας των ΓΤΜ.

5.1.3. Σύγκριση μεταξύ των κλασικών και των μοριακών προσεγγίσεων

Οι όροι «συμβατικοί» και «μοριακοί» σε σχέση με τη μεθοδολογία της γενετικής τροποποίησης των μικροοργανισμών, όπως ήδη αναφέρθηκε, σημαίνουν αύξηση της γενετικής ποικιλομορφίας τους. Το αποτέλεσμα αυτό επιτυγχάνεται μέσω της χρήσης κλασικών μεθόδων για τις παραλλαγές που προκαλούνται αυθόρμητα ή από μεταλλαξιγένεση, με υβριδοποίηση, είτε με μεταφορά γονιδίων. Αυτές οι μέθοδοι είναι ανακριβείς, έμμεσες και λιγότερο ισχυρές σε σύγκριση με τις μοριακές. Ωστόσο, δεν υπάρχει αμφιβολία ότι δεν υπάρχει εννοιολογική διαφορά μεταξύ της γενετικής τροποποίησης των μικροοργανισμών με κλασικές και μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την τροποποίηση του DNA, και της μεταφοράς γονιδίων.

Το Σχήμα 1 δείχνει την γενετική τροποποίηση των μικροοργανισμών και την οδό εισόδου στο περιβάλλον. Εδώ, οι δύο μέθοδοι είναι ενωμένες, δεδομένου ότι δεν έχει σημασία αν χρησιμοποιήθηκαν κλασικές ή μοριακές τεχνικές στα στάδια της αξιολόγησης στο εργαστήριο, στο χωράφι ή στην εισαγωγή μεγάλης κλίμακας στο περιβάλλον.

Σχήμα 1:

Οι αντίστοιχες βιολογικές αρχές που χαρακτηρίζουν αυτή την έννοια περιλαμβάνονται στις εκθέσεις της EFSA]

• Η κύρια εστίαση κατά τη λήψη αποφάσεων σχετικά με την εισαγωγή στο περιβάλλον είναι το προϊόν που λαμβάνεται με την τροποποίηση των γονιδίων και την επιλογή, παρά η ίδια η διαδικασία.
• ο χαρακτηρισμός του προϊόντος απαιτεί πληροφορίες σχετικά με τη διαδικασία που χρησιμοποιείται, αλλά η φύση της διαδικασίας δεν είναι επαρκές κριτήριο για να αποφασιστεί εάν το προϊόν θα παρακολουθηθεί περισσότερο ή λιγότερο.
• η αντίδραση των μικροοργανισμών που τροποποιηθηκαν με μοριακές και κλασικές μεθόδους βασίζεται στους ίδιους φυσικους και βιολογικούς νόμους. Η γνώσεις που αποκτήθηκαν για τα προϊόντα των κλασικών τροποποιήσεων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση των προϊόντων που λαμβάνονται μέσω μοριακών τεχνικών σε σχέση με την σχετική ασφάλεια και την εκτίμηση των κινδύνων.