5.1.2. Μοριακές τεχνικές

Η σύγχρονη εξέληξη της μοριακής τεχνολογίας στις μεθόδους μεταλλαξιγένεσης και μεταφοράς γονιδίων, αυξάνει σημαντικά το φάσμα των μικροοργανισμών που υπόκεινται σε μεταφορά DNA από οργανισμούς που δεν έχουν στενσυγγένεια. Το φράγμα της οικογένειας και το βασιλείου δεν είναι πλέον ανυπέρβλητη περίσταση.

Οι σύγχρονες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στα βακτήρια επιτρέπουν την ολοκλήρωση του ανασυνδυασμένου κατασκευάσματος σε συγκεκριμένες θέσεις του χρωμοσώματος ή των πλασμιδίων. Ωστόσο, οι διαδικασίες για την τροποποίηση των γονιδίων πρέπει να αξιολογηθούν από την άποψη της ασφάλειας τους. Για το λόγο αυτό, το θέμα της συζήτησης είναι τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: τα χαρακτηριστικά του ξενιστή μικροοργανισμού σε σχέση με το γονίδιο (τα γονίδια) που συμπεριλήφθηκαν, τα χαρακτηριστικά του φορέα και του κατασκευάσματος, οι μέθοδοι μεταφοράς DNA.

Όταν τα βακτήρια χρησιμοποιούνται ως μικροοργανισμοί ξενιστές, η διαδικασία για την αξιολόγηση του κινδύνου απαιτεί αποδείξεις για την ασφαλή κατανάλωση αυτού του μικροοργανισμού ως τρόφιμο ή ως συστατικό των τροφίμων. Εάν η απαίτηση αυτή δεν ικανοποιείται, η ασφάλεια του ξενιστή πρέπει να διερευνηθεί και να τεκμηριωθεί. Όταν ο ξενιστής είναι ευκαρυωτικό κύτταρο, εφαρμόζονται οι ίδιες σκέψεις. Το εισαγόμενο γονίδιο (-α) μπορεί να προέρχεται από τον ίδιο μικροβιακό τύπο ή από εξελικτικά πιο μακρινό οργανισμό. Το ένθετο προϊόν του γονιδίου πρέπει να έχει ένα ιστορικό ασφαλούς χρήσης στα τρόφιμα και πρέπει να αποδειχθεί η ασφάλειά του. Όσο πιο μικρό είναι το εισαγόμενο θραύσμα του DNA, τόσο πιο μειωμένη / απλοποιημένη θα είναι η διαδικασία αξιολόγησης της ασφάλεια των τροφίμων.

Όσον αφορά τα χαρακτηριστικά του φορέα και του κατασκευάσματος - εάν ο φορέας χρησιμοποιείται ως τμήμα του γονιδιώματος του ΓΤΜ, η όλη ακολουθία DNA πρέπει να χαρακτηριστεί, συμπεριλαμβανομένων των ρεπλικονίων, των προαγωγών, των επιλέξιμων δεικτών, των συνδετήρων, καθώς και κάθε άλλο κομμάτι του DNA. Ο φορέας πρέπει να περιέχει μια νουκλεοτιδική αλληλουχία των μικροοργανισμών με ιστορικό ασφαλούς χρήσης στα τρόφιμα. Οι επιλεκτικοί δείκτες πρέπει να επιλέγονται πολύ αυστηρά βάσει της ασφαλούς χρήσης και πρέπει να αποφεύγεται οι δείκτες για την ανθενκτικότητα στα αντιβιοτικά. Ωστόσο, εάν αυτοί χρησιμοποιούνται, πρέπει να εφαρμοστούν ειδικές μέθοδοι για το διαχωρισμό τους από το γονιδίωμα του ΓΤΜ (π.χ. ειδική ακολουθία ανασυνδιασμού). Στα ευκαρυωτικά δημιουργούνται ειδικές φορείς κλωνοποίησης, όπως κεντρομερικά πλασμίδια, τεχνητά χρωμοσώματα ζυμομυκήτων, πλασμίδια με βάση τους παράγοντες «δολοφόνους» κλπ.

Όταν μιλάμε για τη μεταφορά DNA, υπάρχει μια απαίτηση για τη χρήση των μεθόδων φυσικής, χημικής και βιολογικής φύσης, που να ελαχιστοποιήσουν τις μεγάλες γενετικές ανακατατάξεις στο γονιδίωμα του ξενιστή. Κατά τη χρήση φορέων ενσωμάτωσης, η αλληλουχία νουκλεοτιδίων των πλευρικών περιοχών στη θέση ενσωμάτωσης στο χρωμόσωμα πρέπει να χαρακτηριστεί.

Οι πληροφορίες αυτές είναι απαραίτητες για την πρόβλεψη του κινδύνου από τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται. Στα ευκαρυωτικά, υπάρχουν ορισμένες μέθοδοι για την άμεση ενσωμάτωση των in vitro τροποποιημένων ή δημιουργημένων κατασκευάσματων γονιδίων σε συγκεκριμένες χρωμοσωμικές θέσεις και για τη διαγραφή των γονιδίων που χρησιμοποιούνται σε ορισμένα είδη. Με βάση αυτές τις μεθόδους, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά κατασκευάσματα οι οποίες είναι πολύ σταθερές κατά τον αγενή πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Υπάρχει επίσης η δυνατότητα ανασυνδυασμού μέσω mating με παρόμοια στελέχη της ίδιας μικροχλωρίδας. Όταν τα γενετικά χαρακτηριστικά του στελέχους που χρησιμοποιείται δεν είναι πολύ γνωστά, οι ανεπαρκείς πληροφορίες σχετικά με τα πιθανά γεγονότα ανασυνδυασμού καθιστά αδύνατη την πρόβλεψη του μηχανισμού και της θέσης ένταξης των ξένων γονιδίων. Έτσι, είναι δυνατόν η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται για γενετικό χειρισμό των ζυμομυκήτων και νηματοειδών μυκήτων να επιτρέπει την ενσωμάτωση σε μεταβλητούς χώρους που προκαλούν την εμφάνιση διαφόρων βιοτεχνολογικών ιδιοτήτων και γενετικής αστάθειας των ΓΤΜ.